Контрацептивные вакцины

За рубежом исследования по созданию контрацептивных вакцин для людей ведутся с конца 1920-х гг. В публикациях ученых, разрабатывающих такие вакцины, обычно подчеркивается, что необходимость в них вызвана ростом численности населения планеты, особенно в странах третьего мира. Ряд западных политиков, придерживающихся неомальтузианских взглядов (neo-malthusianism), высказались о необходимости сокращения численности населения путем массовых вакцинаций контрацептивными вакцинами. Цель данной работы — рассмотреть существующие подходы к конструированию контрацептивных вакцин и определить основные признаки, по которым можно распознать их скрытое применение.

История создания контрацептивных вакцин

Началось все в 1899 г., когда австрийский иммунолог Карл Ландштейнер (Karl Landsteiner, 1868–1943) и русский ученый Илья Мечников (1845–1916), работавшие в Институте Пастера (Pasteur Institute, Париж), независимо друг от друга продемонстрировали, что инъекция гетероспецифической спермы может вызывать антительный ответ у экспериментального животного. В 1929 г. Morris J. Baskin, клинический директор Комитета гигиены матерей Денвера (Denver Maternal Hygiene Committee, США), использовал человеческую сперму для временной стерилизации женщин. В 1937 г. им получен патент на неспецифическую спермотоксичную вакцину и способ ее получения . Активным сторонником иммуноконтрацепции был британский ученый, лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (2010) Роберт Эдвардс (Robert Edwards, 1925–2013), основной разработчик технологии экстракорпорального оплодотворения. С 1972 г. контрацептивные вакцины являются приоритетной программой Всемирной организации здравоохранения (WHO Special Programme of Research, Development and Research Training in Human Reproduction). В осуществлении программы принимает участие Рокфеллеровский фонд (Rockefeller Foundation). До начала 1970-х гг. сперма являлась основным объектом исследований по поиску антигенных детерминант контрацептивных вакцин, предназначенных для людей и животных. За последние 40 лет сложились три основных направления конструирования контрацептивных вакцин:

1) блокирующих образование гамет;

2) нарушающих их функцию;

3) нарушающих формирование зародыша и его имплантацию в матку (нарушающие процесс оплодотворения).

В таблице показан достигнутый уровень конструирования и возможные ограничения для массового применения контрацептивных вакцин.

Основные отличия контрацептивных вакцин от вакцин, используемых для специфической профилактики инфекционных болезней

В 1978 г. V.C. Stevens сформулировал два основных отличия контрацептивных вакцин от традиционных. Во-первых, антигены контрацептивных вакцин могут быть выбраны только из биологически активных молекул, в норме не вызывающих иммунного ответа. То есть основной задачей разработчиков таких вакцин является либо нарушение иммунологической толерантности к таким молекулам, либо придание им «перекрестной активности» к молекулам, участвующим в репродуктивной функции человека. Во-вторых, контрацептивные вакцины должны блокировать развитие беременности на прогнозируемый период времени.

Гормональная регуляция фертильности человека

В основе регуляции фертильности человека находится действие гонадотропин-рилизинг-гормона (гонадорелин, гонадолиберин, гонадотропин-рилизинг-фактор, gonadotropin-releasing hormone, GnRH; luteinizing-hormone-releasing hormone, LHRH) и индуцируемых им гонадотропных гормонов передней доли гипофиза: фолликулостимулирующего гормона (фоллитропин, follicle stimulating hormone, FSH) и лютеинизирующего гормона (лютеотропин, лютропин, lutropin, lutrophin, luteinizing hormone, LH). GnRH образуется секреторными клетками гипоталамуса (отдел промежуточного мозга). Гипоталамус формирует с гипофизом единый функциональный комплекс. GnRH непосредственно взаимодействует со специфическими рецепторами клеток-гонадотропов, расположенных в передней доле гипофиза, и вызывает усиление секреции FSH и LH. В большей степени GnRH влияет на секрецию лютеинизирующего, чем фолликулостимулирующего гормона. Благодаря действию FSH и LH на гонады GnRH играет важную роль в регуляции репродуктивной функции у человека и животных. Он индуцирует синтез половых стероидных гормонов, сперматогенез и созревание фолликулов, влияет на сексуальное поведение. FSH стимулирует у женщин развитие интерстициальной ткани яичников и овуляцию, что приводит к усиленной секреции женских половых гормонов — эстрогенов. У мужчин FSH вызывает развитие семенных канальцев, стимулирует сперматогенез и секрецию мужских половых гормонов — андрогенов. Действие FSH и LH взаимосвязано и синергично. Под влиянием FSH созревающие фолликулы продуцируют эстрогены, среди которых наибольшее значение имеет эстрадиол. Одновременно FSH индуцирует в фолликулах экспрессию рецепторов к LH. В результате к моменту созревания фолликула уровень эстрадиола становится настолько высоким, что это приводит к активации гипоталамуса (т.е. GnRH) по принципу положительной обратной связи и интенсивному высвобождению LH и FSH гипофизом. Повышение уровня LH запускает овуляцию, при этом из яичника не только высвобождается яйцеклетка, но и инициируется процесс лютеинизации — превращения остаточного фолликула в желтое тело , которое, в свою очередь, начинает вырабатывать прогестерон для подготовки эндометрия к возможной имплантации. LH необходим для поддержания существования желтого тела примерно в течение 14 суток. В случае наступления беременности лютеиновая функция будет поддерживаться действием гормона трофобласта — хорионического гонадотропина (HCG). LH стимулирует клетки в яичниках, продуцирующие андрогены и предшественники эстрадиола. HCG начинает образовываться плацентой плода с первых часов беременности. Его продукция возрастает в несколько тысяч раз к 7–11-й неделе, затем постепенно снижается. Благодаря секреции значительных количеств HCG желтое тело, в норме существующее около 2 недель в течение каждого менструального цикла, у беременных не подвергается рассасыванию и остается функционально активным в течение всего срока беременности. Причем желтое тело у беременных под влиянием HCG производит большие количества прогестерона, физиологически невозможные в норме в небеременном организме. Схема гормональной регуляции фертильности человека приведена на рисунке.

HCG обладает биологическими свойствами как LH, так и FSH и связывается с обоими типами рецепторов к гонадотропинам. Лютеинизирующая активность у HCG значительно преобладает над фолликулостимулирующей. По лютеинизирующей активности он значительно превосходит «обычный» LH, производимый передней долей гипофиза. Овечьи и человеческие гонадотропины (LH, FSH) структурно сходны между собой. Антитела к этим гормонам обладают перекрестной нейтрализующей активностью.

Вакцины, блокирующие образование гамет

К ним относятся вакцины, блокирующие действие GnRH, FSH и LH. Вакцины на основе гонадотропин-рилизинг-гормона. GnRH представляет собой декапептид с молекулярной массой (ММ) 1182 Да, общий для большинства млекопитающих. Установлена важная роль первых трех аминокислотных остатков в молекуле GnRH для проявления им биологической активности и боковых цепей аминокислотных остатков в положениях 2, 3 и 6 для связывания с рецепторами клеток-гонадотропов. Модификация аминокислот в этих положениях позволила получить высокоактивные и длительно действующие аналоги GnRH. Из-за небольшой ММ и простоты строения молекулы антигенные свойства GnRH минимальны. В некоторых работах его рассматривают как гаптен. Наименьшая ММ веществ, к которым удалось получить антитела без их присоединения к другим, более крупным молекулам, составляет примерно 1000 Да (вазопрессин, ангиотензин). Поэтому конструирование вакцин фертильности на основе GnRH с самого начала пошло по пути повышения его антигенных свойств. В конце 1980-х гг. для решения этой технической задачи использовалось конъюгирование GnRH с иммуностимулирующими носителями, в качестве которых обычно использовали дифтерийный и столбнячный токсоиды, В-субъединицу экзотоксина А псевдомонад (например, с носителем, имеющим ММ до 1 мДа, ковалентно сшивали от двух до семи молекул GnRH), масляные, поликатионные адъюванты, FSH и LH и др. В 1990-х гг. разработчики вакцин фертильности стали увеличивать плотность антигенных эпитопов путем получения методами генной или белковой инженерии мультимерных (до 12 молекул GnRH) или тандемных форм GnRH. Затем их конъюгировали с высокоиммуногенными носителями либо смешивали с эффективными адъювантами, например с полным адъювантом Фрейнда. Открытие в 1997 г. второй формы GnRH, названной GnRH-II (соответственно, первая его форма в тех случаях, когда сравнивается их действие, обозначается как GnRH-I), показало, что управление фертильностью со стороны гипоталамуса является значительно более сложным процессом, чем считалось ранее. GnRH-I и GnRHII синтезируются разными нейронными системами и отличаются друг от друга по антигенным свойствам. Предполагается, что основная роль GnRH-I-нейронов в гаметообразовании заключается в периодической стимуляции синтеза LH (созревание гамет и синтез половых стероидных гормонов), в то время как основная роль GnRH-II-нейронов — преовуляторные выбросы LH. Открытие двух форм GnRH привело к созданию вакцин, представляющих их композиции (GnRHI/GnRH-II). Такие вакцины разрабатываются для лечения рака простаты у людей и кастрации животных. Однако вакцины, включающие иммуностимулирующие носители и адъюванты, имеют ряд серьезных недостатков, проявляющихся при массовом применении. Адъюванты вызывают образование абсцессов и гранулем, иммуностимулирующие носители — эффект доминирования, когда основной иммунный ответ приходится на них. Кроме того, сам процесс образования конъюгатов GnRH и носителей с использованием карбодиимидной реакции трудно предсказуем по получаемым конечным продуктам. Поэтому в прошлом десятилетии сформировались новые направления конструирования GnRH-вакцин:

— введение в антигенную композицию пептидов с эпитопами, распознаваемыми Th-хелперами, — белка F вируса кори, белка CSP возбудителей малярии и др. Такие композиции формировались путем слияния через спейсерную группу пептидов, обладающих выраженными антигенными свойствами, с GnRH;

— использование в качестве антигена белковых структур рецепторов, специфических для GnRH;

— использование в качестве антигена слитых с GnRH гликозилированных белков (устранение эффекта доминирования иммуностимулирующего носителя в иммунном ответе на GnRH).

Наиболее типичной для современных GnRH-вакцин является вакцина Improvac®. В России она свободно продается для ветеринарных нужд. По техническому уровню соответствует разработкам второй половины 1980-х гг. Ветеринарные вакцины GonaCon®, ReproBLOC® отличаются от нее составом адъювантной композиции и схемами применения.

Вакцина Improvac®. Производится Pfizer Inc. В основном используется в свиноводческих хозяйствах для кастрации хряков и получения мяса «без запаха». Одна доза вакцины в качестве действующего вещества содержит 0,4 мг аналога GnRH, конъюгированного с дифтерийным анатоксином, 300 мг ДЭАЭ-декстрана в качестве адъюванта, 0,2 мг тиомерсала в качестве консерванта, мочевину и стерильную воду в качестве вспомогательных веществ. В результате вакцинации в сыворотке крови животного резко понижается уровень тестостерона, LH, FSH, снижается вес и уменьшаются размеры семенников, простаты. Клетки Лейдига пикнотизируются, их количество сокращается. Нарушается сперматогенез (атипичная форма сперматозоидов, утраты головки, дефекты акросомы и др.). Аналогичные данные получены M. Hilbe et al. Вакцины на основе лютеинизирующего гормона. LH по строению похож на другие гормоны-гликопротеины: тиреотропный гормон, HCG, FSH. Его ММ 28,5 кДа. Гликопротеин представляет собой димерную структуру, состоящую из двух субъединиц — альфа и бета, соединенных двумя дисульфидными мостиками, к каждой из которых присоединены углеводные остатки. Альфа-субъединицы LH, тиреотропного гормона, HCG, FSH идентичны и состоят из 92 аминокислотных остатков. Бета-субъединицы гормонов различаются. Бета-субъединица LH (121 аминокислота) определяет его биологическое действие, специфически взаимодействуя с мембранным рецептором. Она содержит ту же последовательность аминокислот, что и HCG, и стимулирует тот же самый рецептор. Однако HCG имеет 24 дополнительных аминокислоты, и оба гормона существенно отличаются друг от друга своими углеводными компонентами. Различная структура олигосахаридных фрагментов влияет на биологическую активность и скорость разрушения гормонов. Период полураспада LH составляет 20 мин, что короче, чем у FSH (3–4 ч) и HCG (24 ч). Известно о двух направлениях конструирования вакцин на основе LH: 1) в качестве антигенной детерминанты используется его бета-субъединица; 2) в качестве антигенной детерминанты используется наружная часть рецептора клеток, специфически взаимодействующего с LH. Прототипная вакцина создана в средине 1980-х гг. на основе бета-субъединицы LH и полного адъюванта Фрейнда. В опытах на нечеловекообразных приматах было показано ее контрацептивное действие. При вакцинации бычков вакциной на основе конъюгата LH с человеческим сывороточным альбумином достигнуто снижение уровня тестостерона в сыворотке и редукция яичек. Антитела, полученные в результате вакцинации овечьим LH, оказались способными связывать LH приматов (обезьян и людей) и кроликов. При этом количество тестостерона в сыворотке крови через 8–16 нед. после вакцинации снижалось на 90 %, что приводило к азооспермии. Через 15–18 нед. после вакцинации количество сперматид (развивающиеся мужские половые клетки в период спермиогенеза) в популяции уменьшалось более чем на 90 %; сперматоцитов (развивающиеся из сперматогониев мужски половые клетки, предшественники сперматид) — более чем на 50 %. В качестве антигена использовали аминокислотную последовательность рецептора, специфически взаимодействующего с LH на поверхности клетки-мишени. Результаты были получены противоречивые. В последующие годы оба направления конструирования контрацептивных вакцин на основе LH не получили развития. Вакцины на основе фолликулостимулирующего гормона. FSH — гликопротеин с ММ около 30 тыс. Да. Его молекула состоит из двух различных по структуре субъединиц (альфа-FSH и бета-FSH), нековалентно связанных друг с другом. Молекулы FSH человека и разных видов животных обладают значительной гомологией. Бета-цепь специфична для данного гормона, состоит из 118 аминокислотных остатков. Видовых различий в структуре альфа-субъединицы значительно больше, чем в структуре бета-FSH. Углеводная часть FSH составляет около 15 % его ММ и характеризуется гетерогенностью. Каждая из субъединиц FSH содержит по две олигосахаридные цепи, соединенные с полипептидной цепью N-гликозидной связью, образуемой остатками N-ацетилглюкозамина и амидной группой остатков аспарагина. Олигосахаридные цепи необходимы для соединения субъединиц и поддержания надлежащей конформации молекулы. Также они защищают полипептидные цепи субъединиц от расщепления протеолитическими ферментами. Специфические биологические свойства FSH обусловлены бета-субъединицей, приобретающей биологическую активность после соединения с альфа-субъединицей. Большая часть работ по изучению контрацептивной способности вакцин на основе FSH выполнена с использованием гормона овечьего происхождения. Антитела к овечьему FSH перекрестно реагируют с FSH других видов, в том числе и приматов (обезьяны, человек), но не дают перекрестных реакций с человеческим тиреотропным гормоном и LH, имеющим большое сходство по альфа-субъединицам. Толчком к разработкам вакцин на основе FSH стали исследования, выполненные в 1978–1979 гг. У обезьян, вакцинированных овечьим FSH, обнаружили тестикулярную дисфункцию, хотя никаких изменений в концентрации тестостерона в сыворотке крови не происходило. Конструирование вакцин велось по двум направлениям: 1) повышение иммуногенности FSH или его бета-субъединицы (участка бета-субъединицы, содержащего эпитоп, вызывающий образование антител к рецептору гормона), для чего гормон (бета-субъединицу или ее фрагмент) сорбировали на гидроокиси алюминия либо сшивали с дифтерийным анатоксином или натрий-фталат-производным липополисахарида (sodium pthalate derivative of lipopolysaccharide, SPLPS); 2) получение вакцин на основе аминокислотной последовательности рецептора (аминокислоты 1–134), специфически взаимодействующего с FSH на поверхности клеток-мишеней. Сравнительное исследование антигенных свойств интактного FSH и его бета-субъединицы показало, что антитела к FSH обладают на порядок более сильным аффинным сродством, чем антитела к бета-субъединице. Однако N.R. Moudgall, M. Jeyakumar et al. рекомендовали разработчикам контрацептивных вакцин использовать бета-субъединицу с эффективным адъювантом, а не цельный FSH, так как в этом случае на иммунную систему вакцинированного создается меньшая антигенная нагрузка, обусловленная наличием неспецифических эпитопов у альфа-субъединицы гормона. Специфические антитела, образовавшиеся в результате вакцинации, связывают FSH в сыворотке крови до количеств, не определяемых стандартными иммунологическими методами. Контрацепция, развивающаяся в результате вакцинации FSH и белком его рецептора, является следствием ухудшения качества спермы вакцинированного. Вакцинация белком рецептора FSH, выполненная в опытах на самцах обезьян, показала, что бесплодие может быть достигнуто без наступления азооспермии. Блокирование рецептора FSH существенно влияет на пролиферацию сперматогоний и продукцию сперматоцитов, но мейоз, этап, на котором происходит образование сперматид, оно не затрагивает. Благодаря значительному уменьшению количества сперматогоний, доступных для мейотического деления, у вакцинированного значительно уменьшается количество сперматоцитов. В результате у него развивается олигозооспермия, но не азооспермия. Лишение тестикул регуляторного воздействия гипоталамуса, осуществляемого посредством FSH, приводит к появлению в эякуляте незрелых сперматозоидов. Аналогичным образом меняется качество спермы после вакцинации FSH.

В экспериментах по вакцинации добровольцев овечьим FSH было установлено, что в сыворотке крови не меняется концентрация таких гормонов, как LH, тиреотропный гормон, тестостерон, тироксин, трийодтиронин. FSH (в норме его содержание у мужчин 1–5 нг/мл) может не определяться стандартными иммунологическими методами на пике концентрации специфических антител. Изменения спермы такие же, как у вакцинированных FSH обезьян. Ни первое, ни второе направление конструирования вакцин контрацепции на основе FSH не позволили добиться длительного мужского бесплодия. Вакцинация макак-резусов овечьим FSH привела у них к тяжелым нарушениям сперматогенеза в течение 1–2 лет, однако в течение 4,5 года, несмотря на периодическое повторение вакцинации и олигозооспермию, произошло качественное (но не количественное) восстановление сперматогенеза и фертильности. Причина, почему повторные прививки овечьего FSH не подавили необратимо сперматогенез, осталась неустановленной. При вакцинации рецепторным белком контрацепция оказалась непродолжительной, не более 300 сут., и могла быть достигнута только после двухтрех инъекций антигена с адъювантом. При этом значительно снижалось количество сперматозоидов и их подвижность. Изменения количества тестостерона в сыворотке крови не наблюдалось. Оба направления не получили серьезного развития за последние годы. В более поздней работе R.K. Naz высказано сомнение в перспективности для медицинской контрацепции всего направления создания контрацептивных вакцин, блокирующих образование гамет, в связи с их выраженным влиянием на продукцию стероидных гормонов. По его мнению, такие вакцины широко будут использоваться только в ветеринарной практике для кастрации животных и в терапевтических целях в клинических ситуациях, требующих ингибирования секреции половых стероидов (миома матки, синдром поликистозных яичников, эндометриоз и преждевременное половое созревание — вакцины на основе GnRH и LH).

Вакцины, нарушающие функции гамет

К ним относятся вакцины, нарушающие присоединение сперматозоида к zona pellucida ооцита и блокирующие подвижность и жизнеспособность сперматозоидов. Вакцины на основе антигенов zona pellucida. ZP (ранее называлась zona striata, в русском языке соответствует термин «блестящая оболочка», используемый редко) — прозрачная эластичная гликопротеиновая оболочка вокруг плазматической мембраны яйцеклетки млекопитающих животных и человека. Ее толщина у человека составляет 5–10 мкм. Через нее свободно проникает вода и растворенные в ней вещества, антитела, ферменты и небольшие вирусы. В индивидуальном развитии яйцеклетки ZP образуется на стадии роста, когда она развивается в составе первичного фолликула. Гликопротеины ZP синтезирует яйцеклетка. ZP преимущественно формируют три гликопротеина (ZP1, ZP2 и ZP3), показывающие разную подвижность в полиакриламидном гель-электрофорезе, проводимом в присутствии додецилсульфата натрия (sodium dodecyl sulphate — polyacrylamide gel electrophoresis, SDS — PAGE). В составе ZP человека обнаружены четыре гликопротеина: ZP1, ZP2, ZP3 и ZP4. Классификация гликопротеиновых антигенов ZP формировалась применительно к разным объектам исследования, в разное время, и поэтому в литературе встречаются разные наименования одних и тех же антигенов. Наиболее распространена «мышиная» классификация, ее мы используем в данной работе. Гликопротеины ZP, выделенные из яйцеклеток различных видов млекопитающих, при сходстве структуры самих полипептидов имеют различную подвижность в SDS — PAGE, что является следствием их различной посттрансляционной модификации, включающей гликозилирование. Гликопротеины ZP яйцеклетки человека (human zona pellucidа, hZP) имеют следующую ММ: hZP1 (~100 кДа), hZP2 (~75 кДа), hZP3 (~55 кДа), hZP4 (~65 кДа) [77]. ZP играет основную роль в распознавании и связывании сперматозоида с ооцитом, индукции акросомального эндоцитоза в zona-bound сперматозоида и препятствует проникновению более одного сперматозоида в яйцеклетку, т.е. блокирует полиспермию. ZP2 и ZP3 являются лигандами для рецепторов на головке сперматозоидов, ответственных за связывание с zona pellucida и запуск акросомной реакции. ZP3 индуцирует поглощение сперматозоида яйцеклеткой. После проникновения сперматозоида в яйцеклетке запускается каскад биохимических реакций, приводящий к опорожнению кортикальных везикул — мембранных пузырьков, содержащих литические ферменты. Содержимое кортикальных везикул выбрасывается наружу (в перивителлиновое пространство) и модифицирует zona pellucida таким образом, что последующие сперматозоиды уже не способны проникнуть через нее. Проникновение одного сперматозоида в яйцеклетку — необходимое условие для развития эмбриона. Аминокислотные последовательности белков ZP человека и животных имеют большое сходство между собой.

Представленные в таблице данные объясняют гетероспецифичность антител, образующихся к гликопротеинам ZP разных видов животных и человека. Гликопротеины ZP свиньи (porcine zona pellucida, PZP) обычно используются как антигены выбора для изучения контрацептивного действия таких вакцин у людей и приматов. Сравнительные исследования конт рацептивного действия гликопротеинов ZP человека, проведенные на макаках (Macaca fascicularis) и бабуинах (Papio cynocephalus), показали, что наиболее длительной контрацепции (от 9 до 35 мес.) удается достичь при использовании ZP1 в качестве антигенного компонента вакцины. Данное направление конструирования контрацептивных вакцин активно развивалось в 1980-х гг., повторяя те закономерности развития, через которые прошли вакцины, блокирующие образование гамет. В качестве адъювантов использовался полный и неполный адъюванты Фрейнда, сквален, липосомы и др.; в качестве иммуностимулирующего носителя — дифтерийный токсоид. Для получения высокоочищенных препаратов гликопротеинов гены ZP клонировали в эукариотических и прокариотических организмах и на их основе получали продуценты отдельных гликопротеинов. Одновременно накапливались сведения о поствакцинальных осложнениях, развивающихся через несколько месяцев после вакцинации гликопротеинами ZP. Схема представлений о процессе оплодотворения яйцеклетки, в соответствии с которой антитела конкурируют со сперматозоидами за специфические участки на поверхности ZP и тем самыми блокируют его проникновение в яйцеклетку, не учитывала многие другие варианты событий, вызванные активизацией внутриклеточных сигнальных путей. В конце 1980-х гг. было установлено, что у макак, вакцинированных ZP3 яйцеклетки свиньи (50 мкг) в полном адъюванте Фрейнда, достигался длительный контрацептивный эффект (не менее 540 сут. — срок наблюдения) на фоне высоких титров антител к ZP3, но он сопровождался развитием дегенеративных изменений в яичниках. Гистологическое изучение яичников, извлеченных из животных, вакцинированных ZP3 в полном адъюванте Фрейнда, показало заметное снижение количества фолликулов. Яичники в основном содержали первичные фолликулы, расположенные вдоль периферии кортекса. Вторичные фолликулы были значительно меньших размеров, чем в норме. Они выглядели как сотовые агрегаты, связанные через базальную пластинку. Эти остатки фолликулярной ткани находились в процессе рассасывания и были окружены фиброзной соединительной тканью и гиалиновым веществом. Лейкоцитарной инфильтрации, характерной для хронического воспалительного процесса, не было отмечено. Аналогичные результаты в те годы были получены другими исследователями, но у них оставалась надежда на то, что фолликулярные осложнения вызваны либо действием адъюванта, либо наличием примесей других белков, попавших в вакцину вместе с плохо очищенным первичным сырьем, получаемым исследователями на бойне. С целью получения более гомогенных препаратов гликопротеинов ZP использовали технологию рекомбинантной ДНК. Гены ZP клонировали и переносили в специальные клетки-продуценты, полученный продукт тщательно очищали от примесей других белков и конъюгировали с дифтерийным токсоидом. Но результаты оказались разочаровывающими. Конкуренции со сперматозоидами за специфические участки на поверхности ZP не получилось. Развитие стерильности у вакцинированных собак сопровождалось дегенеративными изменениями яичников. Бабуины (Papio anubis), которым была введена экспериментальная вакцина на основе рекомбинантных обезьяньих (Macaca radiata) ZP1 и ZP2, конъюгированных с дифтерийным токсоидом, остались бесплодными уже после того, как из сыворотки их крови исчезли антитела к этим гликопротеинам. Гистологическое исследование яичников иммунизированных обезьян позволило установить наличие фолликулов, подвергшихся обратному развитию или не достигших зрелости (atretic follicles), и дегенеративные ооциты, что объясняло бесплодие животных в отсутствие антител, специфических к ZP1 и ZP2 [13]. Из ZP-вакцин наибольшее применение в ветеринарной практике нашли SpayVacTM и IVT-PZP (ImmunoVaccine Technologies™, IVT; Галифакс, Новая Шотландия, Канада). Вакцины предназначены для снижения фертильности диких животных, кроме семейства кошачьих. Содержат комплексы гликопротеинов ZP, полученных из яйцеклеток свиней путем водно-тепловой экстракции. В качестве адъюванта преимущественно используется полный адъювант Фрейнда или другие масляные адъюванты. Основное отличие вакцины SpayVacTM от IVT-PZP в том, что у нее антиген включен в липосомы (собственная запатентованная технология). Различаются способы приготовления антигенов, схемы вакцинации и состав адъювантов при первичной и бустерной вакцинациях. Блокируют фертильность животного на период от 22 мес. до 7 лет (в зависимости от вида животного, используемого адъюванта и схемы вакцинации). По техническому уровню соответствуют разработкам второй половины 1980-х гг. В более поздних патентах на контрацептивные вакцины в качестве антигена ImmunoVaccine Technologies™ защищаются гликопротеины ZP, полученные по технологии рекомбинантной ДНК.

Вакцины, блокирующие подвижность и жизнеспособность сперматозоидов

Это направление конструирования вакцин фертильности появилось в конце 1920-х гг. и с тех пор считается исследователями самым перспективным. Причина такого оптимизма заключается: 1) в простоте самой идеи использования белков сперматозоидов в качестве антигенов для вакцинации как мужчин, так и женщин; 2) результатах ранних экспериментов M.J. Baskin, показавшего возможность достижения временного бесплодия у мужчин и женщин, вакцинированных экстрактами спермы; 3) обнаружении антигенных свойств у спермы. Антитела к сперматозоидам обнаруживают у 70 % вазэктомированных мужчин и в 2–30 % случаев семейного бесплодия, ассоциированного с присутствием антител к сперматозоидам у мужчин и/или женщин. Однако ожидания быстрого успеха в создании универсальной контрацептивной вакцины оказались слишком оптимистичны. В конце 1980-х гг. был идентифицирован только 1 % белков сперматозоидов, и еще меньше было известно о том, какие из них доступны для действия антител. По данным Suri Anil и R.K. Naz наиболее исследованными антигенами сперматозоидов, рассматриваемых специалистами как антигены для вакцин фертильности, являются следующие. SPAG9 (sperm associated antigen 9) — белок с ММ 79 кДа. Видимо, находится в головке сперматозоида, так как специфическая к нему сыворотка склеивает сперматозоиды «головка к головке». Антитела к этому белку обнаружены у бесплодных женщин с нормальными эндокринными профилями и не имеющих сужения маточных труб. Антитела к SPAG9 перекрестно реагируют со спермой многих видов животных. PH-20 (PH-20 antigen) — бифункциональный плазмомембранный белок спермы, обладающий гиалуронидазной активностью. Позволяет акросоме сперматозоида пройти через слой клеток вокруг ооцита и благодаря акросомальной реакции связаться с zona pellucidа. Вакцинация морских свинок обоих полов антигеном PH-20 приводила к бесплодию животных. Впоследствии было показано, что у самцов вместе с бесплодием развивался аутоиммунный орхит, проявлявшийся отсутствием сперматозоидов в придатке яичка. SP-10 — акросомальный специфический белок, обнаруженный в сперматозоидах людей, мышей, лис, обезьян (бабуинов и макак), крупного рогатого скота и свиней. Входит в наружный акросомальный комплекс белков. В эксперименте в условиях in vitro антитела к белку SP-10 блокируют проникновение сперматозоидов в яйцеклетку хомяка. Специфическая лактатдегидрогеназа яичек LDHC4 (testis specific lactate dehydrogenase LDH-C4) — ферментативно активная тетрамерная форма фермента с ММ 140кДа. LDH-C4 изучается уже более двух десятилетий и поэтому хорошо охарактеризована. Считается очень перспективным антигеном для вакцин фертильности данного типа. Однако в экспериментах на яванских макаках, когда использовался конъюгат LDH-C4 с участком молекулы столбнячного токсина, включающим эпитоп для Т-клеток, снизить фертильность вакцинированных животных не удалось.

MDC-белок (metalloprotease/disintegrin/cysteinerich protein) — семейство интегральных мембранных белков, включающих различные по первичной структуре металлопротеиназоподобные домены (metalloproteinase-like domain), также известные как ADAM-семейство белков (ADAM family protein). В , ADAM2),bфертильности играют роль белки семейства, синтезирующиеся в яичках: фертилин бета (fertilin циритестин (cyritestin, ADAM3; tMDC I), ADAM 5 (tMDC II), ADAM 6, ADAM 16 (xMDC 16), ADAM 18 (tMDC III), ADAM 20, ADAM 21, ADAM 24 (testase 1), ADAM 25 (testase 2), ADAM 26 (testase 3), ADAM 29 и ADAM 30. Пять из белков семейства ADAMs (фертилин бета, циритестин, ADAM 5, ADAM 16, ADAM 18) имеют отношение к процессу оплодотворения яйцеклетки и/или созреванию сперматозоидов. Их основная роль в процессе оплодотворения заключается во взаимодействии между плазматическими мембранами сперматозоида и яйцеклетки. ) — один из первых хорошо охарактеризованных «клеточных дезинтегринов»bФертилин бета (fertilin (cellular disintegrins). Вызывает слияние сперматозоида и яйцеклетки. Фертилин бета является одной из субъединиц димеризованного антигена спермы (dimeric sperm antigen), который перекрестно реагирует с одним из антител, ингибирующих фертилизацию, известных как PH-30. Фертилин бета и циритестин имеют сходные аминокислотные последовательности. Белок DE (protein DE; acidic epididymal glycoprotein, AEG) — гликопротеин, ММ 37 кДа. В течение эпидидимального созревания (эпидидимальный, т.е. относящийся к придатку яичка) находится в дорсальном регионе головки сперматозоида. Антитела к белку DE/ AEG ингибируют его проникновение в свободную зону яйца (zona free egg). Пептидная последовательность YLP12 (peptide sequence YLP12) — обнаружена в сперме человека и участвует в связывании сперматозоида с яйцеклеткой. Включает 12 аминокислотных последовательностей (YLPVGGLRRIGG). Для исследования контрацептивного эффекта в экспериментах на мышах -субъединицей холерного токсина в качестве b-использовался конъюгат декамера YLP12 с нетоксической иммуностимулирующего носителя. Конъюгат вводили экспериментальным животным двумя способами: парентерально и интраназально, другие адъюванты не использовались. Оба способа вакцинации оказались эффективными: в сыворотке крови и слизистой влагалища обнаружены антитела, специфически связывающие сперматозоиды. Фертильность животных оказалась полностью подавленной в течение не менее 305–322 сут. после появления в крови антител к декамеру. Антитела к YLP12 обладали контрацептивным действием. Они блокировали капацитацию, акросомальную реакцию и способность сперматозоидов мышей и человека связываться с яйцеклеткой. Пептидные последовательности эпитопов рас